Verkunarháttur sýklalyfja rotvarnarefna byggist fyrst og fremst á truflun á frumubyggingu og lífeðlisfræðilegri starfsemi örvera.
Í fyrsta lagi trufla þau frumuhimnuna: virku innihaldsefni ákveðinna sýklalyfja rotvarnarefna hvarfast við lípíð og prótein í frumuhimnum örvera og breytir þar með gegndræpi himnunnar. Þetta leiðir til leka á innanfrumuinnihaldi, sem leiðir að lokum til örverudauða. Til dæmis geta ákveðin katjónísk rotvarnarefni aðsogast á bakteríuflöt, breytt rafgetu frumuhimnunnar og valdið himnuskemmdum.
Í öðru lagi hamla þeir ensímvirkni: ensím gegna lykilhlutverki í umbrotum örvera og taka þátt í margs konar lífefnafræðilegum viðbrögðum. Örverueyðandi rotvarnarefni bindast virkum stöðum ensíma og gera þau óvirk; þetta hindrar efnaskiptaferla og hindrar örveruvöxt og æxlun. Til dæmis geta ákveðin brennisteins- rotvarnarefni hvarfast við ensím inni í bakteríufrumum og þannig gert þær óvirkar.
Í þriðja lagi hafa þau áhrif á erfðaefni: erfðaefni örveru stjórnar vexti hennar, æxlun og arfgengum eiginleikum. Hlutar í sýklalyfja rotvarnarefnum geta haft samskipti við DNA eða RNA örvera, truflað ferlið við afritun og umritun og þar af leiðandi komið í veg fyrir að örveran fjölgi sér eða lifi eðlilega af. Til dæmis geta ákveðin rotvarnarefni sem innihalda tiltekna efnafræðilega starfhæfa hópa tengst DNA og hindrað afritun þess. Mismunandi gerðir af sýklalyfjum geta sett eitt eða fleiri af þessum verkunarháttum í forgang til að hamla og útrýma breitt svið örvera á áhrifaríkan hátt.
